抗排异是器官移植手术之后必须进行的一项治疗，而抗排异的成功与否，则是器官移植成功的关键因素。其中，霉酚酸就是一种常用的免疫抑制剂，可通过抑制次黄嘌呤一磷酸盐脱氢酶影响B细胞和T细胞增殖所需的嘌呤合成途径，因此可以用于器官移植后的抗排异治疗。然而，在临床过程中，医生往往需要面对这样的一个难题——霉酚酸在个体间的药代动力学差异巨大，外因和内因都能造成用药效果的巨大差别。这一难题成为了横亘在破解抗排异难题之路上的巨大障碍之一。

而要破解这一难题，最关键的就是分析血液中霉酚酸的代谢情况。然而许多现有的霉酚酸分析方法都无法分离霉酚酸与其代谢物MPAG和AcMPAG。这两种葡萄糖苷酸代谢物会发生源内碎裂，进而在霉酚酸MRM通道中生成干扰信号。

因此，沃特世开发了一种蛋白沉淀法，可在临床研究中用于萃取血清霉酚酸。萃取样品之后，进样至配备ACQUITY UPLC HSS C₁₈ SB色谱柱的ACQUITY UPLC I-Class系统进行色谱分离，然后使用Xevo TQD质谱仪进行检测。

实验条件

样品制备

使用ClinCal多浓度校准品套装(Recipe，德国慕尼黑)制备校准品。将霉酚酸(Cerilliant公司，美国德克萨斯州圆石)加标至混合人血浆(Sera Laboratories，英国西萨塞克斯郡)中，制得内部校准品，用于扩大线性范围。使用ClinChek多浓度质控样品套装(Recipe，德国慕尼黑)作为QC样品。使用三氘代(2H3)霉酚酸(Cerilliant公司，美国德克萨斯州圆石)作为内标，将其溶于含有0.1 M硫酸锌的30%甲醇水溶液(沉淀溶液)中，浓度为0.2 g/mL。

样品萃取

取50 L样品至微量离心管中，然后向每个样品中加入500 L沉淀溶液。样品加盖涡旋20 s，然后在18800 g的转速下离心5 min。将上清液转移至1 mL 96孔板中并密封，以待分析。

UPLC条件

系统: 配备FTN的ACQUITY UPLC I-Class

色谱柱: ACQUITY HSS C₁₈ SB, 2.1 x 30 mm,1.8 m (部件号186004117)

流动相A: 水+ 2 mM醋酸铵+0.1%甲酸

流动相B: 甲醇+ 2 mM醋酸铵+0.1%甲酸

清洗溶剂: 90% 甲醇水溶液+0.1% 甲酸

灌注溶剂: 30% 甲醇水溶液

密封清洗 液: 20% 甲醇水溶液

进样前清洗时间: 0 s

进样后清洗时间: 30 s

柱温: 50 °C

样品温度: 4 °C

进样体积: 10 L

流速: 0.70 mL/min

梯度: 表1

运行时间 : 2.5 min(进样之间间隔约3.0 min)

MS条件

系统: Xevo TQD

分辨率: MS1和MS2 (0.75 FWHM)

采集模式: 多反应监测(MRM) (表2)

极性: ESI正离子模式

毛细管电压: 3.5 kV

锥孔电压: 表2

离子源温度: 150 °C

脱溶剂气温度: 600 °C

驻留时间: 0.05 s

扫描间延迟时间 : 0.02 s

通道间延迟时间: 0.01 s

数据管理

带TargetLynx应用管理软件的MassLynx软件4.1版

方法条件

表1.用于分离霉酚酸的梯度表

表2.霉酚酸定量离子、定性离子及其内标(霉酚酸-2H3)的MRM参数指导值

实验结果

将高浓度和低浓度霉酚酸混合样品按不同比例混合，所得样品进行四次重复分析，结果表明，该方法在0.1～20.0 g/mL的范围内呈线性。校准曲线呈线性，确定系数(r2) > 0.994。霉酚酸代谢物实现了色谱分离(见图2)。

图2.使用ACQUITY UPLC HSS C18 SB色谱柱分离霉酚酸及其代谢物的UPLC色谱图

分析灵敏度研究结果表明，该方法可以精确定量0.075 g/mL的霉酚酸(RSD < 20%)。在三天内10次重复进样0.075 g/mL的样品，信噪比均>10:1。

在五天内每天对三个浓度的QC样品进行一次萃取和定量分析(每个浓度五个重复样，n = 25)，以此确定该方法的精密度。表3展示了这些实验的结果，低(0.5 g/mL)、中(2.4 g/mL)和高(5.0 g/mL)浓度霉酚酸分析的总精密度和重现性为RSD  5.3%。

分析40 g/mL的高浓度样品之后，未在后续的空白进样中观察到明显的系统残留物污染。通过1:1稀释成功测定了40 g/mL超线性范围样品，平均准确度为98%，RSD为5.9%。

测定添加和不添加内标时的基质因子，以评估基质效应。低浓度和高浓度QC样品的基质效应平均值分别为0.91和0.94。使用分析物:内标峰面积响应比率计算低浓度和高浓度QC样品的基质效应，得到其平均值分别为0.97和0.96。上述结果表明，单独检测分析物时，内标可补偿轻微的离子抑制效应。

本研究分析了购自国际能力验证(IPT)霉酚酸酯方案(Bioanalytics.co.uk)的样品(n = 12)，并将所得值与HPLC/MS方法平均值进行比较，得到偏差为 5.1%。

表3. 血浆霉酚酸分析的总精密度和重现性，所得数据的变异性以%RSD表示

定量分析对照样品和测试样品(加标高浓度干扰物)中霉酚酸定量分析的相关干扰物并比较结果，测定的所有干扰物之间的偏差均< 10%。测定的干扰物包括霉酚酸的代谢物、内源性化合物(胆固醇和肌酸酐)和外源性化合物(伊曲康唑和依维莫司)。

将沃特世方法所得的样品分析结果与一种独立的霉酚酸LC-MS/MS分析方法所得的结果进行对比(n=35)。使用Analyse-it软件(Analyse-it Software Ltd.)处理数据，软件完成对比后生成了Deming回归方程y=0.90x + 0.13(图3A)。Altman-Bland分析则得到了-0.05%的负平均偏差(图3B)。

表4. IPT样品的分析结果及其与IPT HPLC/MS方法平均值的比较结果

图3.A) Deming回归，对比了Waters UPLC-MS/MS方法与另一种霉酚酸LC-MS/MS分析方法；B) Altman-Bland分析，显示了Waters UPLC-MS/MS方法与一种独立的霉酚酸LC-MS/MS分析方法之间的差异(%)

结论

本研究开发了一种高灵敏度、高准确度且高精密度的UPLC-MS/MS方法，可在临床研究中用于分析人血浆中的霉酚酸。

本方法使用高选择性的色谱成功分离了霉酚酸及其代谢物，无明显残留且基质效应极低。